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Culture cellulaire

  • Établissement de cultures primaires colo-rectales à partir de biopsies endoscopiques ou chirurgicales
  • Génération de cellules dendritiques humaines, macrophages, cellules lymphocytaires… à partir d’anneaux de cytaphérèses.
  • Immortalisation par la technique EBV et culture de lymphocytes B humains
  • Co-cultures (lymphocytes B et lymphocytes TFH, cellules dendritiques et lymphocytes T4, cellules dendritiques et cardiomyocytes, cardio-fibroblastes et cardiomyocytes, etc).
  • Cardiomyocytes ventriculaires humains (lignée AC16)
  • Fibroblastes cardiaques humains ventriculaires (primaires HCF-av)
  • Cellules endothéliales veine ombilicale humaines (primaire HUVEC)
  • Cellules musculaires lisses (artère coronaire humaine primaire HCASMC)
  • Cellules proximales tubulaires rénales humaines (primaires RPTEC/TERT1 et lignée HK-2)
  • Autre :
    • Travail en hypoxie/réoxygénation
    • Tests de mortalité, de prolifération cellulaire
    • Systèmes d'expression hétérologues (HEK293, HeLa)
    • Tests de migration cellulaire (verticale par inserts, plane par "wound-healing") (Fig. 1)

Analyses des Nanovésicules (EVs)

  • Isolement par différentes méthodes (ultracentrifugation, kits..)
  • Caractérisation des EVs (taille, quantité, contenu)
  • Effets des EVs sur l'immunomodulation
 

Electrophysiologie cellulaire

Patch clamp en configurations « voltage-clamp » et « current-clamp » (Fig. 6 et 7)
 

Cytométrie en flux :

Marquages multicouleurs, membranaire, intracellulaire, de signalisation, viabilité, apoptose, autophagie, prolifération, dosages CBA, test d’activation des basophiles (TAB)…
 

Tri cellulaire

  • Trieur cellulaire FACS Melody (BD Biosciences) sous PSM et équipé de 3 lasers (Bleu, Rouge, Violet) : 9 paramètres + FSC/SSC
  • Tri possible en plaques (P384, P96, P48, P24, P6), 2 voies de tri en tubes (1,5 / 2 et 5 ml) ou directement sur lames de microscope.
  • Mode « Single Cell » une cellule par puits pour le clonage
  • Tri cellulaire magnétique (monocytes, lymphocytes B, T4, T8, neutrophiles…)

Tests fonctionnels sur les neutrophiles

Production de ROS, libération de protéases (PR3, Cat G, Elastase), formation de NET, marqueurs d’activation
 

Microscopie

Microscopie à fluorescence, confocale, électronique à transmission

Biologie moléculaire des acides nucléiques et des protéines

  • Extraction acides nucléiques, protéines
  • PCR, RT-PCR, qPCR
  • HRM (génotypage SNP)
  • Western Blot
  • Expression de protéines recombinantes
  • Zymographie en gélatine (Fig. 2)
  • Séquençage des immunoglobulines (VH, VL, Fc) humaines et murines
  • Expression d’Ig recombinantes avec système d’expression en cellules HEK et CHO
  • Transformation bactérienne et amplification de plasmides

Immunologie

ELISA, ELISpot, Multiplex

Immunohistochimie – Immunocytochimie (Fig. 3-4-5)

Figure 1 : Initial state of the scratch-wound assay for colorectal primary cells.
Spheroids for human cancer cells at the beginning of the video recording t = 0 and at the end of the experiment t = 48h. 
Figure 2: Gelatin zymogram for concentrated supernatants from cancer cell monolayer cultures.
 
Figure 3. Human primary cells from colorectal tissue immunostained for viment
Figure 4. Immunofluorescence for Vimentin in MDAMB231 cells.
Figure 5. Positive transfected TDP43-GFP pyramidal neuron.
Figure 6 : Voltage gated sodium channels expressed in different colorectal cancer cell lines. Voltage-Clamp whole cell configuration.

Figure 7 : Spontaneous action potentials (AP) obtained from hippocampal neurons. Current-clamp whole cell configuration.